多重连接探针扩增法®
● 多重连接探针扩增法（多重连接探针扩增）是一种检测高达50种不同的基因组DNA或RNA序列的异常拷贝数量的多重PCR方法，能够区分只有一个核苷酸不同的序列（1）。

● 多重连接探针扩增法技术易于使用，并且可以在许多实验室应用，因为它仅需要一thermocycler和毛细管电泳设备。高达96个样品可同时处理，可以在24小时内得出结果。虽然在大多数遗传条件下，（部分）基因缺失或重复的致病突变占不到10 ％，对于许多其他疾病，这一比例为10至30 ％（ 2-8 ），甚至更高（ 9， 10）。

● 因此多重连接探针扩增法列入临床的设置可以大大提高许多遗传性疾病的检出率。

多重连接探针扩增法的优点
使用多重连接探针扩增法检测的拷贝数相对于其他技术有许多优点。

首先，被主要作为检测点突变而开展的方法，如测序和变性高效液相色谱法，一般不能检测拷贝数的变化。

另一方面Southern blot分析，将揭示许多畸变，但不能发现小缺失，并且不是理想的常规技术。虽然PCR可以检测特点良好的缺失和扩增，许多确实的准确切入位点还不明确。

此外，在比较MLPA法与FISH时，MLPA法不仅具有多重的技术的优点，并且对非常小的目的DNA序列（ 50-70nt），使用MLPA法可以确定因为太小而不能被FISH检测到的频繁的，单一基因畸变。

此外，MLPA法可用于纯化DNA 。

最后，相比阵列比较基因组杂交，MLPA法是一种成本低，技术简单的方法。

尽管MLPA法并不适用于整个基因组的研究筛选，对于许多日常应用，这是以阵列为基础的技术的一个很好替代。

现在超过300套商用生产的探针致力于应用，范围从比较常见的（Duchenne， DiGeorge氏综合病征，SMA）到非常少见的（遗传性胰腺炎，凝血酶缺失，霍格-杜贝综合征）。

多重连接探针扩增法的反应
MLPA的典型特点是，它不是扩增靶序列，而是扩增与靶序列结合的MLPA探针。

相比较一个标准的多重聚合酶链反应，用MLPA扩增只用一对PCR引物。

由SALSA MLPA试剂盒产生的扩增产物的长度范围在130到480nt之间，可用毛细管电泳进行分析。

获得的峰值与参考样品进行比较，可看到该序列显示的异常拷贝数。

MLPA反应可以分为五个主要步骤：1) DNA的变性和MLPA探针的杂交; 2) 结合反应; 3) PCR反应; 4) 电泳分离扩增产物;5) 数据分析（图1）。

第一步， DNA变性和MLPA探针混合过夜。

MLPA由两段独立的寡核苷酸组成，每段含有一个PCR引物序列。

这两个寡核苷酸探针立即结合到邻近目标序列（图1 -第1步）。

只有当这两个探针寡核苷酸都结合在与其相邻的目标，在链接反应时它们才能链接起来（图1 -步骤2 ）。

因为只有链接的探针才能在随后的PCR反应中成倍扩增（图1 -第3步），链接探针的数量是衡量样品中的目标序列数的范本。

利用毛细管电泳分离扩增产物（图1 -步骤4 ）。

只包含一个引物序列的寡核苷酸探针不被链接。因此，它们不能成倍扩增，不会产生信号。在MLPA中不用移去未结合的探针，使MLPA法更容易操作。

（图 1）

多重连接探针扩增法的演化
MLPA的少数变化已经制定出来。RT-MLPA（逆转录酶多重连接探针扩增法）可用于mRNA的表达（ 11 ）。

因为连接酶不能链接结合到RNA上的探针，RT-MLPA程序首先把mRNA反转录成cDNA。

随后，RT-MLPA以正常的MLPA反应继续。

另一个变化是甲基化特异性MLPA（MS-MLPA），可用于拷贝数定量和甲基化特异性扫描（ 12 ）。

SALSA MLPA已经在被证明为一种非常有效的方法应用于检测印记疾病（ 13-15 ）和肿瘤样本畸变的甲基化分析（ 16 ， 17 ）。

SALSA MLPA试剂盒迅速增加的应用可以从MRC，荷兰（阿姆斯特丹，荷兰）获得。
可用的SALSA MLPA试剂盒清单可以在这里找到。

参考文献/References

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